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                                      2016.01.18   點擊2650次

                                      1、什么是iTRAQ?
                                          iTRAQ技術,即同位素相對標記與絕對定量技術。該技術可對復雜樣本、細胞器、細胞裂解液等樣本進行相對和絕對定量研究,具有較好的定量效果、較高的重復性。由于其能夠同時對多達8種樣品進行標記分析,故在生命科學的各個領域得到了廣泛的應用。
                                      2、iTRAQ的原理是什么?
                                          iTRAQ的檢測可以做這樣的比喻,蛋白被打成肽段后,被平均的鋪在了一個有384個孔的平板上,然后機器會從每個孔中選取濃度在前5名的蛋白進行鑒定和比對,所以,如果假設每個一個樣本中有100個蛋白,他們的濃度均為1%,那么得到的結果就是蛋白的得分低,但是鑒定的蛋白數量會很多,可以達到90以上;如果一個樣本中有100個蛋白,有3個蛋白的含量分別為30、20、10、其他的97鐘蛋白為剩下的50%,那么這三種蛋白的得分高,但是鑒定出的蛋白數量會比較少,也許只有50或者60個。因為一些高豐度的蛋白會大量分部在上述的小孔中,抑制了其他蛋白的檢出效果。
                                      3、iTRAQ的主要優勢有哪些?
                                          (1) 高通量
                                          一次性定性和定量該樣本的總蛋白,不用像雙向電泳(2DE)或DIGE要逐個斑點做鑒定;2DE可分離1500-2500個斑點(并且可能很多斑點對應同一種蛋白),而iTRAQ一般可鑒定2000種以上蛋白,其中常規動物組織或細胞可鑒定到4000-7000種蛋白;
                                          (2) 結果直觀、分析靈活
                                          直接得到蛋白的定性和相對定量信息,可利用統計學方法快速篩選出各個組別的差異蛋白;能更好的結合基因組或轉錄組的數據,十分有利于后續研究。
                                          (3) 對樣本類型無限制
                                          任何類型的樣本均可做,當然數據庫越全、鑒定到的蛋白種類越多;對于罕見物種,可提供轉錄組數據來檢索,更容易找到有意義的蛋白。
                                          (4) 加了數據的可靠性和相關性
                                          一次上機的樣本數高達8個,如果樣本數多于8個,還可以在每次上機時設置內參,每個樣本先跟內參比較,再相互比較(排除操作、環境和儀器誤差),從而實現多組樣本間的差異蛋白分析。
                                      4、iTRAQ與其他蛋白質組學技術的區別是什么?
                                          雙向電泳是最早、最經典的蛋白質組技術,適用于大部分樣本,只是對強酸或強堿性蛋白,以及分子量太大或太小的蛋白質分離效果不好;另外由于各個樣本需要單獨跑膠,很難避免操作誤差對結果的影響,可能導致定量不準確;但是雙向電泳的服務價格相對便宜,可以用于樣本差異的初步篩選;
                                          DIGE在雙向電泳基礎上做了改進,引入了熒光標記物和內標,可以使定量更加準確;但該技術也是依據蛋白的等電點和分子量分離,因此對強酸或強堿性蛋白,以及分子量太大或太小的蛋白質分離效果也不好。
                                          iTRAQ、TMT、label-free和SILAC都是利用液質聯用技術來尋找差異蛋白。其中,iTRAQ和TMT的原理和檢測方法基本一致,只是使用了不同的標記物;TMT有10種標記物,可對多達10種不同樣本進行分析,但是由于其標記物的質量數非常相近,因此必須使用超高分辨率的質譜才可以滿足檢測,這也必然會導致信號干擾更多,可能會影響定量的準確性;label-free是非標記的蛋白質組學技術,由于沒有標記物,其定量需要依賴于操作和質譜儀的穩定性,該技術鑒定到的蛋白數目會少于iTRAQ技術,并且定量的準確性較差,優勢是服務費用較低;SILAC是基于穩定同位素標記的細胞培養技術的蛋白質組學方法,利用不同的同位素培養基來培養不同組別的細胞,達到體內標記的目的,其定量準確性要比其他蛋白質組學技術更高;但是由于缺乏合適的同位素培養基,該方法基本只能用于可傳代的哺乳動物細胞系。
                                      從定量準確性、應用性等各方面綜合考慮, iTRAQ技術已成為近年來利用最廣泛的蛋白質組學技術。
                                      5、iTRAQ實驗對樣本有何要求?
                                          任何類型的樣本都可以,如果是罕見物種,可以用近緣物種的數據庫檢索,也可提供轉錄組數據庫來檢索;一次上機,每組樣本需要用200μg蛋白,但由于需要蛋白定量檢測和預實驗,因此每組樣本所需的蛋白量大概在500μg左右;我公司負責蛋白質的提取,客戶只需要提供足夠的原始樣本。
                                      6、不同類型的樣本做iTRAQ能否一次上機?
                                          不能。如果樣品來源于不同物種,檢索時就無法選擇數據庫,也就無法分析數據;即使是同一物種的樣本,它們的蛋白種類和豐度也可能有很大差別(比如植物的根和葉),將這些酶切肽段混合上機,其數據會相互干擾,導致蛋白定性和定量的不準確。
                                      7、iTRAQ實驗是否需要設置重復?
                                          通常重復包括生物學重復和技術重復,iTRAQ中常說到的還有上機重復;生物學重復即樣本重復,采集來源于同一組別的不同樣本(例如同樣處理的不同植物、同一疾病的不同患者血清等),通常設置3個生物學重復,但臨床樣本一般要求生物學重復更多(如疾病組和健康組各十幾例樣本);當生物學重復的樣本很多時,可以將同組樣本混合后再標記,便可以通過一次上機檢測;技術重復,通常是同一個樣本用不同標記物標記,這樣可以排除因蛋白提取、酶解、標記等操作引入的誤差;另外iTRAQ實驗有時會設計上機重復,這其實也屬于技術重復的范疇,即相同的樣本上兩次機,來排除操作誤差和儀器誤差。目前發SCI論文一般需要設置重復(無論何種重復),否則可能會被質疑數據的準確性;另外從數據質量上講,重復能更有效的幫助我們排除不可信蛋白,無論是對WB驗證還是后續研究,都是很有利的。
                                      8、iTRAQ的重復性好不好?
                                          iTRAQ重復性通常是指定量的重復性,即同樣的樣本在上機兩次時得到的結果是否一致;iTRAQ實驗重復性的好壞就決定了數據的準確性。一般來說,由于質譜選取肽段的隨機性,可能導致檢測到的肽段及其強度不同,在經過軟件匹配分析后,得到的蛋白比值可能會不一樣。一般得分和比值比較靠后的蛋白才會出現定量的嚴重偏差,而絕大部分蛋白的比值趨勢是一致的。因此在分析時,我們會將鑒定到的蛋白先按FDR(錯誤發現率)或unused值進行篩選,選取置信度大于95%(unused>1.3)或99%(unused>2)的蛋白作為可信蛋白,再進行分析。
                                      9、按什么標準來選取差異蛋白?
                                          差異蛋白的選取目前并沒有統一標準,有多種選擇方法,根據比值篩選,結合比值和標準差篩選,或根據T-Test篩選;我們目前一般根據比值進行選擇,即差異倍數≤0.67和≥1.5,有時也會按照p≤0.05的標準過濾。
                                      10、iTRAQ實驗的數據采用不同數據庫檢索時,各組間的比值為何是不同的?
                                          iTRAQ技術中不同標記物之間的比值與檢索數據庫、質譜電信號的噪音以及采集質譜時的隨機性都有關。所以在使用不同數據庫檢索時,由于匹配肽段情況的不同,定量結果也有些許差異,但是總體變化趨勢應是一致的。
                                      11、檢索時為什么同一個編號對應了很多蛋白質?
                                          因為一個蛋白家族中常常含有多個同源性很高的蛋白質,這些蛋白質被酶切之后,很可能會產生很多相同的肽段,軟件在進行定性分析時,就會將這些肽段均歸于得分最高的那種蛋白質,其他同源蛋白不計分,并且這些同源蛋白都采用同一編號。
                                      12、LC/MS中蛋白處理是定量還是定性?
                                          這是屬于定量,需在蛋白定量后,各取相同量(50-100μg)的蛋白(體積不大于25μl,少于25μl的用專用裂解液補至25μl)進行還原化和烷基化。 
                                      13、LC/MS對需要檢測的蛋白有量的要求嗎? 
                                          有。要求蛋白量最低50μg,濃度最低要為5μg/μL,否則同位素無法標記。
                                      14、數據分析中主要看哪些參數?
                                          對于液質聯用的數據分析,一般觀察的參數為:Total Ion Score C.I. %(可信度)和Tag-80/Tag-0(兩樣本的比值)。 
                                      15、眾多可信度數值中,主要選擇哪些進行研究? 
                                          一般來說可信度在80%以上的均為可信程度非常高的。有些蛋白可信度在60%以上的也可以作為參考數據。 
                                      16、可信程度低于80%的數據有意義嗎?
                                          可信程度低于此值的,如果有感興趣的蛋白可以通過ELISA、WB、Q-PCR、液態芯片等技術手段進一步驗證,畢竟LC/MS是研究蛋白組學的方法之一,如全面研究還是要綜合各種研究方法。
                                      17、兩樣本的比值都代表什么? 
                                          兩樣本的比值如果在0.9-1.1之間的,可以認為兩樣本的含量是一樣的,即比值為1:1;而小于0.9或大于1.1均可認為兩樣本之間的比值是有差異的。
                                      18、質譜圖中顯示的是各種蛋白嗎? 
                                          不是各種蛋白而是蛋白被打碎后的離子圖譜,由于質譜法是電場和磁場將運動的離子(帶電荷的原子、分子或分子碎片)按它們的質荷比分離后進行檢測的方法。測出的是離子的準確質量,由此來確定離子的化合物組成。

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